本文講述了如何將單柱層析轉(zhuǎn)化為雙柱層析（MCSGP）用于純化治療性寡核苷酸，從而顯著提高產(chǎn)品的收率以及生產(chǎn)效率。
采用2根相同的層析柱，將第1根層析柱洗脫下的低純度組分回收到第2根層析柱繼續(xù)純化，可同時保證純度和收率。在本例中，單柱層析的收率僅為60%，而MCSGP在滿足目標純度要求前提下的收率則高達94%，顯著優(yōu)于單柱層析。MCSGP工藝開發(fā)，是通過Contichrom HPLC系統(tǒng)的MCSGP向?qū)к浖韺崿F(xiàn)的。
介紹
化學合成的寡核苷酸已廣泛應(yīng)用于DNA測序、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和分子克隆。寡核苷酸的未開發(fā)潛力在于其以靶向方式修飾基因表達的能力，從而為人類疾病帶來新的、有效的治療效果。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，寡核苷酸已成為繼小分子、多肽和蛋白質(zhì)藥物之后的主要開發(fā)藥物之一，預(yù)計寡核苷酸藥物將很快應(yīng)用于以往無法治療的遺傳疾病上。鑒于寡核苷酸的合成成本較高，收率的增加將會對生產(chǎn)的經(jīng)濟性產(chǎn)生重大好處。
治療性寡核苷酸的生產(chǎn)過程需要去除合成副產(chǎn)物，以使藥物純度符合要求，一般需采用層析方法進行精純，但這通常會使收率降低40-60%。作為對策，可以將純度較低的產(chǎn)品單獨收集，并選擇再次進行層析提純，但這會明顯降低生產(chǎn)效率，而且會增加分析檢測的工作量。因此，迫切需要有更先進的層析手段來提高收率，并替代現(xiàn)有的層析方法。
MCSGP（Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification）可同時保證高純度和高收率，有結(jié)果表明，與單柱層析相比，MCSGP可在滿足目標純度的前提下，使產(chǎn)品收率提高至90%。因此，MCSGP克服了單柱層析時收率和純度無法兼得的問題，并且由于收率的提高，通常還可保證更高的生產(chǎn)效率和更低的溶劑消耗量。
MCSGP原理
圖1. 傳統(tǒng)單柱層析（左）：重疊組分被舍棄或暫時保留以再次進行層析。
MCSGP（右）：將重疊組分進行循環(huán)回收，不斷去除雜質(zhì)，收集純產(chǎn)品。
與單柱層析不同，MCSGP是使用2根相同的層析柱進行連續(xù)層析（圖1）。然而，兩者的分離原則是基本一致的，即在層析過程中，都將樣品分離得到3部分：純產(chǎn)物、雜質(zhì)和產(chǎn)物的重疊組分、僅含雜質(zhì)的部分。收集純產(chǎn)物部分，舍棄或重新處理含有雜質(zhì)的重疊組分。如果將重疊組分舍棄，會使有價值的產(chǎn)物發(fā)生損失。對重疊組分進行再處理會積累雜質(zhì)，因此適用性受到限制。此外，將重疊組分暫時保留并再次進行層析會降低整體生產(chǎn)效率。MCSGP通過內(nèi)部回收（recycle）重疊組分，反復(fù)分離雜質(zhì)和純產(chǎn)物，從而同時保證純度和收率。組分的回收過程是自動完成的，不需要進行離線分析。重疊組分從一個層析柱轉(zhuǎn)移到另一個層析柱，并在每個cycle中會有新的樣品再次上柱。這樣可以確保連續(xù)操作，并在不影響純度的情況下獲得高收率的產(chǎn)品。
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材料和方法
在30%氨水中制備治療性寡核苷酸，最終濃度為45 g/L，并通過反相HPLC測得純度為73.8%（圖2）。
圖2. 上樣樣品反相層析分析圖譜
反相層析方法：采用單柱層析和雙柱MCSGP純化寡核苷酸，兩種模式均通過Contichrom HPLC 30層析系統(tǒng)進行操作，并記錄280 nm處紫外吸收值。使用2個內(nèi)徑0.77 cm、柱床高度10 cm的Hiscreen Q Sepharose FF柱（柱體積為2×5 mL）。溶劑為25 mm NaOH（A相）和25 mm NaOH+2 M NaCl（B相）。對于單柱層析，每次上樣量為每mg填料上樣1 mL。產(chǎn)品洗脫采用在線性梯度從10%B到90%B進行24 CV（柱體積）。共進行3次單柱層析操作，1次作為性能基準（Benchmark），2次作為MCSGP設(shè)計的基礎(chǔ)。
圖3. ChromIQ軟件Batch向?qū)Ы缑?/span>
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單柱（Batch）方法是使用Batch向?qū)?chuàng)建的，如圖3所示。表1為單柱層析參數(shù)。
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表1. 單柱層析參數(shù)比較。方法名稱中的數(shù)字（150&300）對應(yīng)洗脫流速。
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Benchmark使用20cm床高進行。運行MCSGP時，使用10cm床高的層析柱2根，以保證在recycle步驟中2柱串聯(lián)時的總高度不超過20cm。因此，僅運行單個10 cm層析柱的步驟（洗脫、清洗、CIP、再生）可以在2倍至3倍的線性流速下進行，而不超過層析柱的壓力限制。這將會轉(zhuǎn)化為更高的生產(chǎn)效率。采用10cm層析柱進行單柱層析，洗脫流速為300cm/h（Batch Run 300），作為MCSGP設(shè)計的基礎(chǔ)。分段收集，并采用HPLC對各分段組分進行分析檢測，以生成準確的純度曲線，從而快速實施MCSGP。
單柱層析結(jié)果
圖4和圖6為單柱層析圖譜。使用反相HPLC測定各洗脫組分的純度，并用超微量分光光度計測定各洗脫組分的濃度（圖5和圖7）。
圖4. Benchmark：Contichrom系統(tǒng)單柱層析圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導(dǎo)率）
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圖5. Benchmark：洗脫組分檢測結(jié)果
圖6. Batch Run 300（用于MCSGP設(shè)計）：Contichrom系統(tǒng)單柱層析圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導(dǎo)率）
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圖7. Batch Run 300：洗脫組分檢測結(jié)果
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這兩種單柱層析的詳細過程參數(shù)比較見表5。在要求目標純度>91%的情況下，與Benchmark的20cm床高相比，采用10cm床高可產(chǎn)生更高的生產(chǎn)效率，這是因為10cm床高可使用更高的線性流速。然而，Batch Run 300的收率會比Benchmark低5%，這是因為滿足純度要求的收集范圍較窄。
MCSGP設(shè)計
可以單柱層析結(jié)果為基礎(chǔ)，通過MCSGP向?qū)呻p柱MCSGP方法（見圖8）。Contichrom系統(tǒng)的ChromIQ軟件可提供MCSGP向?qū)Чδ堋?/span>MCSGP采用與單柱層析相同的層析柱、溶液體系和相同的層析方案。
圖8. MCSGP向?qū)В阂詥沃鶎游鰣D譜為基礎(chǔ)，整個MCSGP設(shè)計過程可在15分鐘內(nèi)完成。
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在STEP1中，需要將單柱層析圖譜加載到MCSGP向?qū)В▓D9）。在STEP2中，需要將檢測得到的各洗脫組分純度和濃度結(jié)果與單柱層析圖譜進行疊加。
圖9. MCSGP向?qū)Ы缑?/span>
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在STEP3中，通過拖動不同顏色區(qū)域的邊界，將層析圖譜劃分為純產(chǎn)物（Product）、重疊組分（Recycle）以及雜質(zhì)（Waste）（圖9和圖10）?？捎上到y(tǒng)軟件模擬計算得到收集樣品的純度，并可根據(jù)區(qū)域劃分的變化自動進行更新。
圖10. MCSGP向?qū)?/span>STEP3示意圖，其中包括Recycle區(qū)域（A-B為藍色，C-D為綠色）和Product區(qū)域（B-C為紅色）
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圖9和圖10突出顯示了三個區(qū)域，分別為1個Product區(qū)域（紅色）和2個Recycle區(qū)域（藍色和綠色）。MCSGP過程具體如下：
A：產(chǎn)品洗脫出峰時開始進行回收（Recycle）；
B：產(chǎn)品純度達到90%時開始收集目標物（Product）；
C：產(chǎn)品純度低于90%時結(jié)束收集目標物，并再次開始回收（Recycle）；
D：產(chǎn)品洗脫完畢，結(jié)束回收。
在STEP4中，可設(shè)定層析柱規(guī)格及上樣體積。MCSGP所使用的2根層析柱的規(guī)格型號、裝填高度均與單柱層析時相同。MCSGP向?qū)鶕?jù)紅色區(qū)域與藍色、綠色區(qū)域的面積比例，自動調(diào)整上樣量，確保工藝穩(wěn)定。
在STEP5中，輸入與單柱層析相同的層析工藝參數(shù)，MCSGP向?qū)詣佑嬎愠鱿♂屢蜃?，從而保證回收組分被稀釋后可與層析柱再次結(jié)合。
在STEP6中，MCSGP向?qū)Э梢阅M計算出相關(guān)工藝參數(shù)并進行顯示，包括產(chǎn)品純度、生產(chǎn)效率、上樣量、溶液消耗量以及收集樣品的濃度，并可設(shè)定cycle次數(shù)。此外，MCSGP向?qū)н€可自動生成 start-up和shut-down方法。整個MCSGP設(shè)計過程可在15分鐘內(nèi)完成。
分別以150 cm/h、300 cm/h和450 cm/h的洗脫流速進行了3次MCSGP運行，以保證在層析柱耐壓范圍內(nèi)進行工藝測試，見表2。
表2. MCSGP方法參數(shù)比較。方法名稱中的數(shù)字（150、300和450）對應(yīng)洗脫流速。
MCSGP操作
圖11為MCSGP Run 150層析圖譜，此為MCSGP的典型圖譜。層析圖譜顯示了2根層析柱可交替進行洗脫操作。2根層析柱在每個cycle中各會完成一次洗脫。
ChromIQ軟件還可以將連續(xù)過程（如MCSGP）的多個cycle進行疊加（圖12）。疊加圖譜表明從cycle2開始進入穩(wěn)態(tài)。
圖11. MCSGP Run 150層析圖譜，共顯示5個cycle
圖12. MCSGP純化寡核苷酸的疊加圖譜，共5個cycle。該圖顯示出洗脫曲線的變化很小，洗脫峰也很相似。第1組洗脫產(chǎn)物來自柱2（藍色曲線），第2組洗脫產(chǎn)物來自柱1（紅色曲線）。
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每個cycle會進行2次收集，每柱各1次。檢測表明，每個cycle的產(chǎn)量、濃度、純度均一致。圖13為MCSGP的5個cycle分析圖譜疊加。HPLC檢測結(jié)果顯示，三種不同洗脫流速的MCSGP產(chǎn)品純度均高于91%的目標閾值，每次均運行5個cycle，見表4。
圖13.寡核苷酸反相分析圖譜，5個cycle的疊加顯示出一致的產(chǎn)品質(zhì)量。此圖為MCSGP Run 150的結(jié)果，三種不同洗脫流速的MCSGP檢測結(jié)果相似。
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表3為MCSGP Run 300的5個cycle工藝參數(shù)與MCSGP向?qū)M計算結(jié)果的對比。實測數(shù)據(jù)與模擬計算結(jié)果接近，說明可以在單柱層析結(jié)果的基礎(chǔ)上，將MCSGP向?qū)ё鳛閿?shù)據(jù)預(yù)測工具使用。
表3. MCSGP Run 300工藝參數(shù)與MCSGP向?qū)M計算結(jié)果的對比
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單柱層析與MCSGP工藝對比
從收率、純度、生產(chǎn)效率、產(chǎn)品濃度和溶液消耗等方面對單柱層析和雙柱MCSGP進行了計算和比較，MCSGP在各方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢（表5）。
將采用20cm床高的Benchmark與采用10cm床高的單柱模式（Batch Run 150和Batch Run 300）進行了對比，與預(yù)測情況相同，較短層析柱的收率會明顯低于較長的層析柱，這是因為較短的層析柱分辨率較低。然而，如果不考慮收率，就生產(chǎn)效率而言，較短的層析柱優(yōu)勢更明顯，尤其是在使用較高流速時。與采用20cm床高的Benchmark相比，采用10cm床高的單柱模式（共2根層析柱，累計床高20 cm）收率會從60%降至55%，但生產(chǎn)效率會提高3倍。
MCSGP的主要優(yōu)點是在目標純度大于91%的前提下，與所有單柱模式相比，產(chǎn)品收率可顯著提升。按照測試流速，在92%純度要求前提下，MCSGP收率可比Benchmark單柱模式高出50-57%，詳見表5、圖12和圖14。MCSGP收率也顯著優(yōu)于10cm床高的單柱模式。
在生產(chǎn)效率方面，MCSGP的優(yōu)點是在洗脫時可運行比Benchmark更高的流速，這是因為柱床高度降低了一半，層析柱反壓更低。這意味著，與Benchmark相比，MCSGP可使生產(chǎn)效率翻倍，而保證收率仍高于90%（圖15）。將MCSGP直接與10cm床高的單柱模式進行比較，發(fā)現(xiàn)10cm床高的單柱模式生產(chǎn)效率更高。首先，與MCSGP相同，10cm床高的單柱模式支持采用更高的流速。其次，與MCSGP不同，10cm床高的單柱模式?jīng)]有2柱串聯(lián)的步驟，因此避免了采用較低流速的過程。最后，由于MCSGP的recycle功能，每cycle的新樣品上樣量都會受限，本例中，每cycle的新樣品上樣量約為單柱模式的50%。實際上，對于許多大規(guī)模的寡核苷酸生產(chǎn)來講，收率增加5%比生產(chǎn)效率提高3倍更具有經(jīng)濟意義，這是因為寡核苷酸的合成成本很高（見表 5 Benchmark與Batch Run 300對比）。事實上，由于MCSGP在提高收率方面優(yōu)勢明顯，預(yù)計提高收率部分所產(chǎn)生的價值將迅速抵消購買連續(xù)流設(shè)備的成本投入（見文獻Müller-Sp?th, T., & Bavand, M. (2019). Purification of Synthetic Peptides by Countercurrent ?Chromatography (MCSGP)-Economic Evaluation. Pharmaceutical Engineering,? 39(2), 68–77）。因此，應(yīng)該把提高純化收率作為本研究的主要目的。
表4. 三種不同洗脫流速MCSGP結(jié)果對比
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表5. 單柱層析與MCSGP運行過程對比
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圖14. MCSGP（三角形）和單柱層析（圓形）帕累托曲線。
該圖表明，MCSGP有效克服了單柱層析時收率和純度無法兼得的問題。
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圖15. MCSGP（三角形）和單柱層析（圓形）收率-生產(chǎn)效率對比圖
總結(jié)
與單柱層析相比，MCSGP在寡核苷酸純化方面具有明顯優(yōu)勢。主要包括：
1.?????? MCSGP可使寡核苷酸收率提高50%以上。在要求產(chǎn)品純度為92%時（目標純度大于91%），單柱層析的收率為60%，而MCSGP的收率可高達90%。
2.?????? 寡核苷酸收率的提高可顯著降低上游寡核苷酸合成的工作量及成本投入。
3.?????? 與Benchmark相比，MCSGP可使生產(chǎn)效率翻倍。
4.?????? 大幅度減少了送檢樣品數(shù)量。（MCSGP每cycle需要上樣2次，但僅產(chǎn)生1個送檢樣品，而單柱層析每次上樣都會產(chǎn)生多個送檢樣品。）
5.?????? 其它工藝參數(shù)與單柱層析接近。
通過MCSGP提高生產(chǎn)效率，可應(yīng)用于多種生產(chǎn)方式：
1.?????? 可采用更小規(guī)格的層析柱，在相同的時間內(nèi)，完成與單柱層析相同的生產(chǎn)任務(wù)；
2.?????? 可采用與單柱層析相同規(guī)格的層析柱，在更短的時間內(nèi)完成生產(chǎn)任務(wù)；
3.?????? 層析填料體積相同時，可在相同時間內(nèi)獲得更多的產(chǎn)品。
層析系統(tǒng)介紹
Contichrom HPLC：Contichrom HPLC是一套多用途的制備型實驗室級層析系統(tǒng)，可運行多種單柱和雙柱層析。ChromIQ是Contichrom系統(tǒng)的操作軟件，其中包括MCSGP向?qū)Чδ堋?/span>
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EcoPrime Twin HPLC ：EcoPrime Twin HPLC為生產(chǎn)型連續(xù)流層析系統(tǒng)，可在GMP條件下運行MCSGP功能，滿足MCSGP工藝的有效線性放大。
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